°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð_《白头翁皂苷抗肿瘤作用及机制研究.caj 》



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白头翁皂苷抗肿瘤作用及机制研究.caj
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pichkoo.com电子书 癌症是危害人类生命健康的严重疾病之一,发病率逐年上升,寻找恶性肿瘤有效的防治方法迫在眉睫。化内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖药物治疗是当今治疗肿瘤的主要手段之一,但化疗药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞,产生免疫功能低下、骨髓抑制、脏器受损等毒副作用,严重的副作用和多药耐药等问题使其应用受到很大的限制。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð中药具有多成分、多靶点的作用特点,可作用于肿瘤发病的不同环节,同时其毒副作用低,能提高机体免疫力,不易产生耐药性,因此,中药及其活性成分成为近年来抗肿瘤药物研究的热点。常用于治疗肿瘤的中药有清热解毒药、补益类药、活血化瘀药、利水渗湿健脾类药,其中以药性寒凉的清热解毒药所占的比例最大。

白头翁皂苷抗肿瘤作用及机制研究作  者 : 罗颖颖内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖位授予单位 :  湖南中医药大内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖位名称 : 博士导师姓名 : 郭建生;陈兰英内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖位年度 : 2014关键词 : 白头翁皂苷;肿瘤;凋亡;自噬;能量代谢;多成分
°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð摘  要 : 癌症是危害人类生命健康的严重疾病之一,发病率逐年上升,寻找恶性肿瘤有效的防治方法迫在眉睫。化内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖药物治疗是当今治疗肿瘤的主要手段之一,但化疗药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞,产生免疫功能低下、骨髓抑制、脏器受损等毒副作用,严重的副作用和多药耐药等问题使其应用受到很大的限制。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð中药具有多成分、多靶点的作用特点,可作用于肿瘤发病的不同环节,同时其毒副作用低,能提高机体免疫力,不易产生耐药性,因此,中药及其活性成分成为近年来抗肿瘤药物研究的热点。常用于治疗肿瘤的中药有清热解毒药、补益类药、活血化瘀药、利水渗湿健脾类药,其中以药性寒凉的清热解毒药所占的比例最大。白头翁属清热解毒类中药,本课题组前期从白头翁药材中提取得到白头翁皂苷(多成分)后,进行体内外抗肿瘤药效实验确定其为白头翁抗肿瘤的有效部位(总皂苷可测得成分含量达90%以上,所含皂苷成分量达75%左右),并进一步对总皂苷中主要成分进行了分离鉴定及体外抗肿瘤活性筛选和构效关系研究,目前确定了具有抗肿瘤活性的有效成分为B3、B7、B9、B11等,本课题在此基础上,进行系统的白头翁皂苷抗肿瘤作用药效内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖研究及抗肿瘤作用机制研究,为白头翁抗肿瘤新药开发及其临床应用提供坚实的理论基础。目的在前期研究基础上,进行系统的白头翁皂苷抗肿瘤作用药效研究,并从诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞自噬、调节肿瘤细胞能量代谢等方面出发,进行白头翁皂苷极其中有效成分B3、B7等抗肿瘤作用机制研究,以期通过对白头翁皂苷中的多成分(B3、B7等)抗肿瘤作用机制研究,阐明白头翁皂苷抗肿瘤作用是否通过多靶点协同整合调节而产生的,从而科内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖诠释白头翁皂苷的多成分,多途径,多机制的抗肿瘤作用,为白头翁抗肿瘤新药开发及其临床应用提供坚实的理论基础。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð方法第一部分白头翁中抗肿瘤有效部位及有效成分的确定通过体外培养人肝癌Bel-7402、SMMC-7721细胞及人结肠癌HT-29、HCT-116细胞;体内建立H22肝癌小鼠移植瘤模型,进行白头翁皂苷体内外抗肿瘤作用药效确定;通过体外培养人肝癌细胞SMMC-7721,人结肠癌细胞HT29;体内建立H22肝癌小鼠移植瘤模型,进行白头翁皂苷中有效成分B3、B7、B9、B11体内外抗肿瘤作用药效筛选。第二部分白头翁皂苷抗肿瘤药效作用研究1.白头翁皂苷体外抗肿瘤作用研究体外培养BGC-823、SGC-7901、NCI-H460、A549、SMMC-7721、Bel-7402、HT-29、HCT116、U251、SK-0V-3、PC-3及K562共12种肿瘤细胞株,采用MTT法检测白头翁皂苷对肿瘤细胞的增殖抑制率,并计算半效抑制浓度IC50(μg/ml).2.白头翁皂苷抗CT26. WT结肠癌、H22肝癌小鼠移植瘤药效实验分别用CT26.WT结肠癌细胞、H22肝癌腹水接种至BALB/c小鼠和KM小鼠右侧腋窝皮下建立CT26. WT结肠癌、H22肝癌动物移植瘤模型,给药14天,取瘤,称量瘤重计算抑瘤率(%),观察白头翁皂苷对各移植瘤的影响;取动物胸腺、脾脏,称重,计算各组动物脏器指数;取外周血,全自动血球仪检测血细胞情况,观察白头翁皂苷对小鼠血细胞的影响。3.白头翁皂苷抗人癌裸鼠异体移植瘤药效实验分别用人结肠癌HT29、人肝癌Bel-7402细胞裸鼠移植成瘤,再经裸鼠传代2代以上的瘤块,采用套管针接种于裸鼠腋部皮下,建立人结肠癌/肝癌裸鼠异体移植瘤模型。给药24天左右,测量瘤体积,1次/3d,末次给药后取瘤,称量瘤重计算抑瘤率(%),观察白头翁皂苷对各移植瘤的影响;取动物肝脏、脾脏,称重,计算各组动物脏器指数;取外周血,全自动血球仪检测血细胞情况,观察白头翁皂苷对小鼠血细胞的影响。第三部分白头翁皂苷抗肿瘤作用机制研究1.白头翁皂苷诱导肿瘤细胞凋亡作用研究通过体外培养人HT29结肠癌细胞,白头翁皂苷干预48hr后,采用DAPI染色,倒置荧光显微镜观察细胞凋亡形态;AnnexinV/PI双染,流式细胞术观察白头翁皂苷对HT29细胞凋亡率的影响。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð2.白头翁皂苷诱导肿瘤细胞自噬作用研究通过体外培养人HT29结肠癌细胞,白头翁皂苷干预48hr后,采用免疫荧光染色,观察自噬标志蛋白LC3的表达及分布;采用Western blotting检测LC3蛋白表达,白头翁皂苷对HT29细胞自噬发生的影响。3.白头翁皂苷调节肿瘤细胞能量代谢作用的研究通过建立人Bel-7402肝癌裸鼠异体移植瘤模型,白头翁皂苷干预后,采用生物化内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖检测法观察白头翁皂苷对瘤块组织中乳酸和ATP水平的变化;采用比色法和ELISA法观察白头翁皂苷对瘤块组织己糖激酶Ⅱ(HK Ⅱ)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)及琥珀酸脱氢酶含量的影响。4.白头翁皂苷中有效成分抗肿瘤作用机制研究通过体外培养通过体外培养人HT29结肠癌细胞,B3、B7干预48hr后,采用流式细胞术检测观察B3、B7对细胞凋亡作用的影响;采用免疫荧光染色和Westernblotting观察B3、B7对自噬凋亡蛋白LC3的影响;采用生物化内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖检测法观察B3、B7对培养上清中乳酸和葡萄糖含量的影响。5.基于Akt通路白头翁皂苷及其有效成分抗肿瘤作用的分子机制研究通过体外培养通过体外培养人HT29结肠癌细胞,白头翁皂苷、B3、B7干预48hr后,各受试药物对Akt通路以Akt通路为主线,选择其下游与凋亡、自噬及能量代谢相关的路径成员F0X01, Bim, Caspase9, Bcl-2,Bax,Caspase3, Atgl, Atgl3, Beclinl, PI3K Ⅲ, p70s6k, Bad, GSK-3GLUT1, HIFα为目标基因,采用PCR芯片检测,观察白头翁皂苷、B3及B7对其的影响,以期阐明白头翁皂苷多成分、多靶点的作用特点。结果第一部分白头翁中抗肿瘤有效部位及有效成分的确定结果表明,白头翁皂苷体外对人肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721有较好的抑制作用,在25μg/ml抑制率可达100%,IC50值分别为5.12、2.26μg/ml,对人结肠癌HT29、HCT-116亦有较好的抑制作用,IC50值分别为2.03,3.24μg/ml,具有较好的体外抗肿瘤活性;对小鼠H22肝癌移植瘤模型的抑瘤率可达67.5%,抗肿瘤活性显著。进一步的白头翁皂苷中有效成分的药效筛选结果显示,B3、B7、B9、B11体外具有较好的抗肿瘤活性,与白头翁皂苷活性相当;各单体体内对小鼠H22肝癌移植瘤模型亦有一定的抑制作用。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð第二部分白头翁皂苷抗肿瘤药效作用研究1.白头翁皂苷体外抗肿瘤作用研究体外抗肿瘤实验表明,白头翁皂苷对受试的12种肿瘤细胞株均有很好的抑制作用,在浓度为25μg/ml时,对12个细胞株的增殖抑制率均在96%以上,且呈具有良好的剂量依赖关系。对12个肿瘤细胞株的IC50均值范围为:3.44-9.91μg/ml,具有显著的体外抗肿瘤活性。2.白头翁皂苷抗CT26.WT结肠癌、H22肝癌小鼠移植瘤药效实验动物移植瘤实验表明,白头翁皂苷高、中、低剂量(300,200,100mg/kg)组对H22抑瘤率分别为74.37%、61.59%、54.6%;对CT26. WT小鼠结肠癌抑瘤率分别为67.9%,51.35%,22.03%;对动物体重、脾脏有一定的影响,但对动物白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板等均无明显影响。3.白头翁皂苷抗人癌裸鼠异体移植瘤药效实验人癌裸鼠异体移植瘤实验结果表明,白头翁皂苷对Bel-7402肝癌的抑制率高、中、低剂量组分别为42.8%、31.5%、14.9%;对HT29结肠癌抑瘤率高、中、低剂量组依次为30.9%、23.5%、17.8%,具有较好的体内抗肿瘤作用,对动物体重、脾脏有一定的影响,但对动物白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板等均无明显影响,第三部分白头翁皂苷抗肿瘤作用机制研究1.白头翁皂苷诱导肿瘤细胞凋亡作用研究白头翁皂苷干预48h后,HT29细胞凝缩变亮的细胞核较多;流式细胞仪检测细胞凋亡率有所增加,其中10、15、20μ g·mL-1与空白组相比明显增加,具有显著性差异(P<0.05),且呈现一定得剂量依赖关系,表明白头翁皂苷可以诱导HT29细胞凋亡。2.白头翁皂苷诱导肿瘤细胞自噬作用研究由染色结果看出,未经白头翁干预的空白组HT29细胞LC3蛋白在胞质内分布均匀。白头翁皂苷干预后,可能促进了自噬蛋白LC3的活化及降解,出现了碎斑块样的自噬小体;Westernblotting检测结果表明,白头翁皂苷干预后,胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)分解成(自噬体)膜型(即LC3-Ⅱ),表明白头翁皂苷可诱导HT29细胞自噬。3.白头翁皂苷调节肿瘤细胞能量代谢作用的研究生物化内蒙古11选5代理_内蒙古11选5开奖遗漏 - 花少钱中大奖检测法显示白头翁皂苷能明显降低瘤块组织中乳酸和ATP的含量;ELISA结果显示白头翁皂苷可降低糖酵解关键酶己糖激酶Ⅱ(HK Ⅱ)、磷酸果糖激酶(PFK)及丙酮酸激酶(PK)的含量,提高三羧酸循环关键酶琥珀酸脱氢酶(SDH)的含量,说明白头翁皂苷可以调节肿瘤细胞能量代谢。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð4.白头翁皂苷中有效成分抗肿瘤作用机制研究结果表明,与空白对照相比,B3/B7均能诱导肿瘤细胞发生凋亡,除B3低剂量2.5μg/ml外,其余各给药组细胞凋亡率与对照组比较有显著性差异;与空白对照组相比,B3、B7各浓度给药组细胞均表达LC3-Ⅱ,且随着浓度的升高而增多;B3、B7能减少HT29细胞葡萄糖的摄取和乳酸的形成。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð5.基于Akt通路白头翁皂苷及其有效成分抗肿瘤作用的分子机制研究结果表明,与对照组相比,白头翁皂苷组Akt、Caspase9、Caspase3、 GLUT1基因表达明显下调(P<0.05-P<0.001),Atgl基因表达明显上调(P<0.01), Bim和Beclinl基因表达有上调趋势;B3组Akt、Caspase9、 Atgl3基因表达明显下调(P<0.05-P<0.01);B7组Akt、Caspase9、 Caspase3、Atgl3、 GLUT1基因表达明显下调(P<0.05-P<0.01),Bim和Beclinl基因表达明显上调(P<0.05)。°ÙÍþ²ÊƱ¿É¿¿Âð与白头翁皂苷组比较,B3组Caspase9、Caspase3、GLUT1基因表达明显上调(P<0.05-P<0.001)、Atgl基因表达明显下调(P<0.05);B7组Caspase9、Caspase3基因表达明显上调(P<0.05-P<0.01), Atgl3、Atgl基因表达明显下调(P<0.05),说明针对Caspase9、Caspase3、GLUT1、Atgl这些靶基因,白头翁皂苷作用要强于有效成分B3和B7。进一步的蛋白验证结果表明,白头翁皂苷、B3、B7能明显下调pAkt、HIF-α蛋白表达、上调Cleave-Caspase3的蛋白表达。结论1.白头翁皂苷体内外均具有良好的抗肿瘤活性,体外对12种肿瘤细胞的IC50范围在3.44-9.91μg/ml;体内对H22肝癌、CT26.WT结肠癌小鼠移植瘤及人肝癌Bel-7402及结肠癌HT29裸鼠异体移植瘤均具有良好的抑制作用,且对白细胞无明显影响。2.白头翁皂苷通过调控Akt蛋白及其相关路径成员,进而诱导肿瘤细胞凋亡、自噬,调节肿瘤细胞能量代谢发挥抗肿瘤作用;而其有效成分B3、B7均可诱导肿瘤细胞凋亡、自噬,调节肿瘤细胞能量代谢,由此说明,白头翁皂苷抗肿瘤作用可能通过其B3、B7等成分共同作用而产生。
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